Фенотипические методы определения чувствительности к антибиотикам

I. Методы определения МПК (в иностранной литературе принят термин MIC - minimum inhibitory concentration).

МПК — минимальная концентрация антибиотика, подавляющая видимый рост микроорганизма, –основной параметр, характеризующий взаимоотношения между микроорганизмом и антибиотиком. МПК выражается в микрограммах на миллилитр (мкг/мл) или миллиграммах на литр (мг/л).

Основным методом определения МПК является метод последовательных разведений. Для определения МПК заданные концентрации антибиотика (чаще всего с 2-кратным шагом) вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста в присутствии различных концентраций антибиотика. Известны два основных варианта постановки метода последовательных разведений: в агаре и в бульоне. Метод последовательных разведений в бульоне, в свою очередь, может выполняться в макро- и микро-варианте (в объеме ≤ 0,2 мл).

Метод последовательных микроразведений в бульоне является референтным методом определения МПК и регламентируется международным стандартом ISO 20776–1:2019 ("Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Broth micro-dilution reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases"). В Российской Федерации Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации от 10 ноября 2022 г. N 1266-ст утвержден и введен в действие Национальный Стандарт ГОСТ Р ИСО 20776–1-2022, идентичный международному стандарту.

В лабораториях результаты теста МПК используются для оценки чувствительности микроорганизмов (категории чувствительности). Категории чувствительности присваиваются на основе согласованных значений, называемых пограничными концентрациями (англ. breakpoints). Пограничные концентрации не являются неизменными величинами. Они могут пересматриваться, в зависимости от изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Пограничные концентрации публикуются организациями по разработке стандартов, такими как Институт клинических и лабораторных стандартов США (CLSI), Британское общество антимикробной химиотерапии (BSAC) и Европейский комитет по тестированию восприимчивости к антимикробным препаратам (EUCAST). В РФ мониторинг за резистентностью к антибиотикам на региональном и межрегиональном уровнях осуществляет Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ). МАКМАХ также подготавливает и утверждает Российские рекомендации по определению чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

В настоящее время для практических лабораторий доступен целый ряд суррогатных методов определения МПК с использованием коммерческих расходных материалов, например, коммерческие варианты метода микроразведений в бульоне, градиентный метод (E-тесты), полуавтоматические устройства и бактериологические анализаторы т.д.

II. Диско-диффузионный метод (ДДМ)

ДДМ (также известный как тест диффузии на агаре, тест Кирби–Бауэра, дисково-диффузионный тест на чувствительность к антибиотикам и KB-тест) является одним из первых методов определения чувствительности к антибиотикам и до настоящего времени остается наиболее распространенным в практических бактериологических лабораториях. Метод может применяться для исследования большинства бактериальных возбудителей, в том числе и наиболее распространенных бактерий со сложными питательными потребностями. Метод является универсальным для широкого круга антибиотиков и не требует использования специального оборудования.

Принцип диско-диффузионного метода основан на феномене ингибиции роста микроорганизмов под воздействием антибиотиков на плотной (агаровой) питательной среде. Диск с антибиотиками помещается на поверхность питательной среды сразу после посева (инокуляции) культуры. При этом практически одновременно начинается два процесса: диффузия антибиотиков из диска и рост культуры микроорганизма.

ДДМ является стандартизированным методом, в основе которого лежат принципы, изложенные в отчете о Международном совместном исследовании по определению чувствительности к антибиотикам 1972 г. (International Collaborative Study of Antimicrobial Susceptibility Testing, 1972) и опыт работы экспертных лабораторий во всем мире.

Для получения достоверных результатов необходимо четко следовать описанной методике без каких-либо отступлений.

Исследование антибиотикочувствительности бактерий ДДМ включает в себя 4 этапа:

1. Приготовление питательной среды. Для оценки чувствительности бактерий к антибиотикам используют агар Мюллера-Хинтон: без добавок — для бактерий с обычными питательными потребностями и с добавлением 5% дефибринированной лошадиной крови и 20 мг/л β-НАД для бактерий со сложными питательными потребностями (агар Мюллера-Хинтон для прихотливых бактерий): Streptococcus spp. (включая S. pneumoniae), Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Listeria monocytogenes, Pasteurella multocida и других.

2. Приготовление инокулюма (бактериальной суспензии). Для приготовления инокулюма используется метод прямого суспендирования колоний в стерильном изотоническом растворе до плотности 0,5 по стандарту мутности МакФарланда, что приблизительно соответствует нагрузке 1–2 × 108 КОЕ/мл (для Escherichia coli). Стерильной бактериологической петлей или хлопковым тампоном необходимо собрать колонии, выросшие на неселективном агаре в течение 16–20 ч. По возможности следует собирать несколько морфологически идентичных колоний, чтобы избежать отбора атипичных вариантов. Суспензировать полученный материал в стерильном изотоническом растворе и тщательно перемешать до получения однородной мутности. Для измерения оптической плотности бактериальной суспензии в настоящее время используют денситометр (детектор мутности суспензий).

Денситометр (фотометрический прибор для оценки мутности суспензий)

3. Инокуляция чашек с агаром (нанесение бактериальной суспензии). Оптимально бактериальную суспензию следует нанести на агар в течение 15 минут, но не позже, чем через 60 минут после ее приготовления. Инокуляция чашек может производиться вручную путем равномерного нанесения суспензии штриховыми движениями на всю поверхность агара в трех направлениях или с использованием автоматического вращающего устройства.

4. Нанесение дисков с антибиотиками. Диски на поверхность агара необходимо нанести не позже, чем через 15 минут после инокуляции агара. Длительное нахождение инокулированных чашек при комнатной температуре может привести к началу роста бактериальной культуры и ложному уменьшению зоны подавления роста. На одну чашку диаметром 90 мм следует помещать не более 6 дисков.

5. Инкубация. Перед инкубацией следует перевернуть чашки дном кверху и убедиться, что диски не падают с поверхности агара. Начать инкубацию следует не позже, чем через 15 минут после нанесения дисков с антибиотиками. Пре-диффузия антибиотика в агар в случае нахождения чашек при комнатной температуре после нанесения дисков может быть причиной ошибки определения чувствительности — получения зон подавления роста большего диаметра.

Инкубацию чашек Петри проводят при 35 ± 1°С, в обычной атмосфере, в течении 18 ± 2 ч. Прихотливые бактерии инкубируют при 35 ± 1°С, в атмосфера с 4–6% СО2, также в течении 18 ± 2 ч. В некоторых случаях учет результатов проводят после 24 ч инкубации (при определении чувствительности Enterococcus spp. к гликопептидам). 

6. Контроль качества проведения исследования после инкубации. При соблюдении правил подготовки инокулюма и инокуляции чашек с агаром должен сформироваться равномерный сплошной слой бактериального роста (газон). Края зон подавления роста вокруг дисков с антибиотиками должны быть ровными и иметь форму окружностей.

7. Измерение зон подавления роста и интерпретация результатов определения чувствительности. Измерение зон подавления роста может проводится вручную при помощи линейки или штангенциркуля до ближайшего миллиметра или в автоматическом режиме, например, на приборе «Adagio, Bio-Rad»).

Интерпретация диаметров зон подавления роста для определения клинических категорий чувствительности проводится в соответствии с актуальной версией таблиц пограничных значений, представленной на сайте EUCAST (http://www.eucast.org).

8. Контроль качества. Мониторинг качества выполнения исследований по определению чувствительности к антибиотикам проводится с использованием специальных контрольных штаммов. Например, Escherichia coli ATCC 25922 (чувствительный, «дикий» тип), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (чувствительный, «дикий» тип). Кроме того, для подтверждения способности метода выявлять резистентность, опосредованную известными механизмами, необходимо использовать резистентные штаммы (ESBL, MRSA, VRE и др.). Такие как: Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 (продуцент ESBL (SHV-18), Staphylococcus aureus NCTC 12493 (mecA-положительный, гетеро-резистентный MRSA).

Возможными источниками ошибок, возникающих при проведении диско-диффузионного метода, могут быть проблемы, связанные с дисками, питательной средой, условиями проведения исследования и качеством контрольных штаммов.

III. Е-тест

Для определения МПК диффузионным методом в 1988 г. был предложен метод градиентной диффузии, названный позже эпсилометрическим тестом (Е-тестом). Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной. В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

IV. Автоматизированные системы для определения чувствительности

Полностью автоматизированные системы для определения АБЧ – это замкнутые системы, обычно работающие на основе принципов микроразведений в бульоне.

Как правило эти системы используют: 

• метод пограничных концентраций,

• определение МПК (двойные последовательные разведения)

Такие приборы обеспечивают термостатирование, проводят анализ роста бактерий и учет результатов в автоматическом режиме. За счет автоматизации снижаются трудозатраты, увеличивается скорость выдачи и точность результата. Кроме того, программное обеспечение приборов проводит анализ и хранение всех результатов. Из минусов можно отметить невозможность тестирования всех клинически значимых видов бактерий и строго фиксированный набор антибиотиков на панели или карте.

Анализатор VITEK®2 (Biomerieux)

  Бактериологический анализатор BD Phoenix™