Генотипические методы определения чувствительности к антибиотикам

Генотипические методы напрямую определяют конкретные гены или мутации, которые обусловливают резистентность. Варианты генотипических методов разнообразны: от использования ПЦР (полимеразной цепной реакции) и секвенирования кодирующих генов до полногеномного секвенирования с последующим картированием генов резистентности in silico.

1. Технологии секвенирования следующего поколения (NGS - next generation sequencing)

Позволяют проводить массовое параллельное секвенирование миллионов фрагментов ДНК с высокой пропускной способностью. Современные технологии NGS могут быть использованы в трех различных областях клинической микробиологической лаборатории: секвенирование всего генома (WGS - whole genome sequencing), целевое секвенирование метагеномов и метагеномное секвенирование методом "дробовика". Технологии полногеномного секвенирования (NGS) существуют уже несколько десятилетий. В области микробиологии WGS позволяет идентифицировать микроорганизмы и осуществлять надзор за потенциальными вспышками заболеваний. WGS помогает обнаружить не только известные гены и механизмы антимикробной резистентности, но и новые гены или механизмы, которые на данный момент не определены. Пока метод полногеномного секвенирования является время затратным и весьма дорогостоящим, поэтому в подавляющем большинстве случае используется в исследовательских целях.

2. Метод ПЦР

Большинство используемых на практике молекулярных методов определения устойчивости к АМП базируется на технологии ПЦР. Эти методы основаны на амплификации целевых последовательностей ДНК микроорганизма с детекцией продуктов амплификации в реальном времени и могут быть выполнены с использованием в качестве субстрата как колоний микроорганизмов, так и непосредственно клинических образцов, что существенно ускоряет получение результата. Кроме того, на сегодняшний день существуют мультиплексные тесты: в одну постановку ПЦР в реальном времени возможно проведение анализа на 5–8 целевых последовательностей ДНК.

Генетические детерминанты, определяющие фенотип приобретенной антибиотикорезистентности, представлены: хромосомными мутациями, происходящие в core-геноме бактериальной клетки, и генетическими детерминантами, которые могут передаваться горизонтальным путем (например, в виде мобильных генетических элементов (МГЭ). МГЭ могут быть встроены в бактериальные хромосомы, такие как профаги, элементы вставочной последовательности, транспозоны и интегративные и конъюгативные элементы, или могут существовать как внехромосомные молекулы, такие как плазмиды или фаг-плазмиды. Соответственно логичным является осуществлять лабораторный поиск тех целевых генов, которые ответственны за резистентность.

Например, резистентность к метициллину у стафилококков связана с приобретением микроорганизмами дополнительного пенициллинсвязывающего белка (ПСБ2а или ПСБ2'), обладающего пониженной аффинностью к β-лактамным антибиотикам. ПСБ2а кодируется геном mecA, входящим в состав подвижного генетического элемента «стафилококковой хромосомной кассеты mec» (staphylococcal cassette chromosome mec – SCCmec), таким образом, обнаружение гена mecA будет с большой вероятностью говорить о метициллинорезистености данного стафилококка (MRS).

Тест-система БакРезиста GLA («ДНК-технологии») используется для выявления генов резистентности к гликопептидным и бета-лактамным антибиотикам: van A/B (ванкомицину, тейкопланину); mec A (метициллину, оксациллину); tem, ctx-М-1, shv (пенициллинам и цефалоспоринам); oxa-40-like, oxa-48-like, оxa-23-like, oxa-51-like, imp, kpc, ges, ndm, vim (карбапенемам). 

Пример результата генотипического исследования бактериальных культур методом ПЦР (тест-система БакРезиста GLA) с интерпретацией.

3. Синдромные панели с генами антибиотикорезистентности

Недавняя разработка синдромных панелей для быстрого обнаружения патогенов в положительных флаконах с культурами крови, респираторных образцах, фекалиях и спинномозговой жидкости привела к смене парадигмы в клинической микробиологии и клинической практике. Вместо того, чтобы заказывать серию индивидуальных, патоген-специфических анализов, врачи имеют возможность заказать один тест, предназначенный для обнаружения ряда микроорганизмов, связанных с инфекционным синдромом.

Эти мультиплексные анализы требуют минимального времени на ручную работу и подготовку образцов и являются высокоавтоматизированными. Другим ключевым преимуществом этих тестов является их быстрое время выполнения, что позволяет идентифицировать выбранные патогены в течение 1–3 часов (в зависимости от платформы), что теоретически позволяет оптимизировать антимикробную терапию на ранней стадии, а также реализовать соответствующие меры профилактики и контроля инфекций.

Особую значимость имеют панели для диагностики инфекций кровотока, поскольку эти инфекции сопряжены с высокой заболеваемостью и смертностью, а первостепенной задачей является как можно более быстрое назначение пациентам оптимального лечения. Такое синдромное тестирование проводят с положительной гемокультурой (флакон с кровью, который показал наличие роста микроорганизма).

Например, в составе панели BioFire FilmArray BCID Panel 19 бактериальных мишеней: Enterococcus spp., Listeria monocytogenes, Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae, Enterobacter cloacae complex, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Serratia marcescens, 5 грибковых: Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, а также мишени для детекции резистентности: mecA, vanA/ vanB, KPC.

В основе технологии BioFire лежит метод мультиплексной гнездовой ПЦР с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени. Все этапы ПЦР от выделения ДНК/РНК до получения результатов проводятся автоматически, без участия опе

 Анализатор FilmArray 2.0, производитель BioFire, США

Другими примерами синдромных панелей с генами резистентности являются: Luminex Verigene Gram-Positive Blood Culture Test (BC-GP), GenMark ePlex BCID-GN Panel.

Большинство синдромных панелей на инфекции кровотока используют в качестве среды для тестирования положительный бульон для культуры крови. Это означает, что культура крови должна инкубироваться в течение 12–48 часов, прежде чем станет положительной и начнется тестирование. Для более быстрого выявления патогенов кровотока было бы идеальным устранить инкубационный период и проводить тестирование на патогены непосредственно из цельной крови, но пока такие тесты только разрабатываются и проходят испытания, прежде чем войдут в практику.

Хотя мультиплексные анализы имеют потенциальные преимущества по сравнению с обычным тестированием, необходимо учитывать определенные недостатки, в первую очередь их относительно высокую стоимость. Эти тесты в значительной степени являются «дополнительными» тестами, поскольку по-прежнему требуются обычные субкультуры и тестирование на чувствительность к антимикробным препаратам, хотя повторной идентификации изолированных колоний можно избежать, если морфология рассматриваемой колонии соответствует молекулярно обнаруженному микроорганизму. Для получения максимальной пользы эти анализы следует проводить 24 часа в сутки/7 дней в неделю, что добавляет логистических препятствий как для лаборатории, так и для системы здравохранения. Кроме того, панели не охватывают всех возбудителей, также присутствие нуклеиновой кислоты в пробе не всегда свидетельствует о наличии жизнеспособных микроорганизмов.

Доступным тестом в России является система БакСкринУПМ (ДНК-технологии), который можно использовать совместно с тестом на гены антибиотикорезистености БакРезиста GLA как аналог синдромной панели.  Среди бактериальных мишеней присутствуют: Enterococcus spp., Streptococcus spp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus; Acinetobacter sppEnterobacteriales, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Haemophilus influenzaе, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia и другие.