Определение чувствительности бактерий к антибиотикам in vitro

Ввиду распространения резистентности и ее клинических последствий, а также возрастающей сложности механизмов антибиотикорезистентности у бактерий, определение чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам является важнейшей задачей микробиологической лаборатории. Тестирование на чувствительность к антимикробным препаратам (АМП) имеет решающее значение для принятия соответствующих терапевтических решений и методов профилактики инфекций.

Целями определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам in vitro являются:

• Этиотропная антибиотикотерапия. Назначение антибиотикотерапии, прицельно направленной на этиологически значимый возбудитель у конкретного пациента, а также коррекция уже назначенной терапии. Согласно современным представлениям, определение антибиотикочувствительности позволяет прогнозировать эффективность антибиотиков при лечении инфекций;
• Эмпирическая антибиотикотерапия. Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре, а также результатах контролируемых клинических исследований. Таким образом, исследование чувствительности выделенных штаммов помогает в создании протоколов для эмпирической антибиотикотерапии (выбор терапии для будущих пациентов) на основании данных локального мониторинга резистентности;
• Эпидемиологический надзор. Включает в себя микробиологический мониторинг за распространением антибиотикорезистентности среди микроорганизмов в конкретном стационаре, регионе, стране, либо изучение трендов антибиотикорезистености в когортах пациентов по половой и возрастной структуре (например, у детей, беременных), конкретных нозологии или возбудителей (например, мониторинг резистентности возбудителей внебольничных пневмоний, возбудителей внебольничных инфекций мочевывоводящих путей и др.);
• Прогнозирование закупок антибактериальных препаратов в стационаре на основании микробиологического мониторинга;
• Изучение чувствительности у новых препаратов.

Методы определения чувствительности

Тесты на чувствительность к АМП оценивают реакцию бактерий на антимикробный препарат in vitro и предоставляют информацию о клинической терапевтической эффективности. В клинической микробиологической лаборатории стандартный рабочий процесс тестирования на чувствительность к АМП начинается после изоляции и идентификации микроорганизма, что обычно занимает не менее одного дня после отбора и посева образцов. После получения чистой культуры можно использовать различные фенотипические (основанные на росте) подходы, при этом результаты будут доступны через 18–24 часа. Следовательно, для получения профиля восприимчивости изолированной бактерии из клинического образца требуется не менее двух дней.

Практическая реальность такова, что скорость традиционных микробиологических методов зависит от времени культивирования микроорганизма.

За последнее десятилетие или около того мы стали свидетелями широкого внедрения революционных технологий, которые значительно повысили скорость диагностики некоторых инфекций. Среди наиболее важных достижений — разработка мультиплексной ПЦР и время пролетной матрично-ассоциированной лазерной десорбционной ионизационной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Несмотря на улучшения, предлагаемые этими технологиями, в микробиологических лабораториях фенотипическое тестирование по-прежнему занимает 18-24 часа. Перспектива сокращения времени определения АБЧ на основе роста является, с биологической точки зрения, сложной задачей. Большинство антибиотиков оказывают свое действие, воздействуя на некоторые аспекты жизнедеятельности микроорганизмов, такие как: сборка клеточной стенки, синтез белка, репликация нуклеиновых кислот или метаболические пути. Поэтому для того, чтобы тест АБЧ оценил активность антибиотика, тестируемый микроорганизм должен активно размножаться.

Одним из фундаментальных элементов бактериологии являются три фазы кривой роста микроорганизма: лаг-фаза, логарифмическая (или экспоненциальная) фаза и стационарная фаза. Традиционные методы АБЧ требуют, чтобы микроорганизм перешел из лаг-фазы в фазу активного роста или логарифмического роста, чтобы полностью оценить восприимчивость к противомикробным препаратам. Продолжительность роста в лаг-фазе варьируется, но для многих микроорганизмов она может занять несколько часов.

Все лабораторные методы определения чувствительности можно глобально разделить на 2 категории:

1. Фенотипические подходы к тестированию чувствительности к антимикробным препаратам. Являются культурно-зависимыми, т.е. зависят от роста организма для интерпретации потенциальной резистентности.

Включают:

a. Определение минимальной концентрации антибиотика, которая вызывает подавление видимого роста (минимальная подавляющая концентрация, МПК) или гибель (минимальная бактерицидная концентрация, МБК) исследуемого микроорганизма in vitro в бульонной культуре или на плотной питательной среде (некоторые методы, например, методы диффузии в агаре, позволяют оценивать МПК не напрямую, а косвенно);

b. Определение скорости роста/отмирания микробной культуры в присутствии заданной концентрации антибиотика;

c. Выявление определенных факторов устойчивости (маркеров резистентности) с помощью фенотипических тестов (иммунохроматографические экспресс-тесты, метод «двойных дисков» для выявления ESBL, D-тест (тест для выявления индуцибельной устойчивости к клиндамицину у стафилококков и стрептококков), СIM-тест (тест для выявления продукции карбапенемаз у грамотрицательных бактерий (Enterobacterales, P.aeruginosa) и другие).

2. Генотипические подходы к тестированию чувствительности к антимикробным препаратам. Включают: выявление генетических детерминант резистентности при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирование следующего поколения (NGS - next generation sequencing), метагеномные подходы.