Выявление определенных факторов устойчивости (маркеров резистентности) с помощью фенотипических тестов

Фенотипические методы выявления определенных маркеров резистентности часто используются в практических бактериологических лабораториях. Например, при скрининге продукции карбапенемаз (ферментов бактерий, разрушающих карбапенемы) можно выявить сниженный диаметр зоны задержки роста у тестируемого штамма при определении чувствительности к карбапенемам ДДМ или повышенного значения МПК. Эта информация позволяет бактериологу назначить дополнительные тесты (например, генетические), чтобы не пропустить явления резистентности низкого уровня. Примерами фенотипических тестов на антибиотикорезистеность являются: метод «двойных дисков», метод инактивации карбапенемов, мммунохроматографические и колориметрические тесты и другие.

1. Метод «двойных дисков». Метод «двойных дисков» представляет собой вариант классического диско-диффузионного метода определения чувствительности, который позволяет обнаружить продукцию ESBL по наличию расширенной зоны подавления роста между дисками с бета-лактамами (цефтазидимом, цефотаксимомом, цефепимомом или азтреонамом), и диском, содержащим клавулановую кислоту (в виде стандартной комбинации с амоксициллином). Результат исследования оценивается как положительный, если размер зоны подавления роста вокруг любого из дисков с цефалоспорином увеличивается или приобретает форму «замочной скважины» в направлении диска с клавулановой кислотой.

2. Метод инактивации карбапенемов (Carbapenem Inactivation Method – CIM)

Принцип метода – выявление ферментативного гидролиза путем инкубации бактериальной суспензии в присутствии карбапенема. При проведении CIM-теста в качестве источника субстрата используются диски с антибиотиками для определения чувствительности. После инкубации полной петли бактериальной культуры в присутствии диска с меропенемом в течение 2 часов, диск помещается на поверхность агара, инокулированную суспензией контрольного штамма Escherichia coli ATCC 25922. Признаком ферментативной инактивации карбапенема является отсутствие зоны подавления роста вокруг диска; формирование зоны подавления роста свидетельствует об отсутствии карбапенемазной активности в результате подавляющего действия негидролизованного меропенема.

 Метод инактивации карбапенемов. 1 – контроль; 2 – изолят K. pneumoniae, не продуцирующий карбапенемазы; 3 – изолят K.  pneumoniae, продуцирующий карбапенемазы.

3. Биохимические (колориметрические) тесты

Например, колориметрический Carba-NP тест – быстрый (<2 ч) тест для выявления гидролиза карбапенема. Гидролиз карбапенема приводит к изменению рН среды, что проявляется изменением цвета раствора, в который добавлен индикатор феноловый красный, с красного на желтый. Положительный тест говорит о продукции микроорганизмом карбапенемазы.

  Carba NP тест. Желтый - изолят K. pneumoniae, продуцирующий карбапенемазы NDM + OXA48; розовый – контроль.

4. Выявление гидролиза карбапенемов с помощью MALDI-TOF

Принцип метода – выявление снижения амплитуды или исчезновения пиков, характерных для карбапенемов, в масс-спектре бактериальной суспензии, предварительно инкубированной в присутствии карбапенема, с помощью массспектрометра (MALDI-TOF). До настоящего времени оценка этого нового метода в многоцентровых исследованиях или множественных одноцентровых исследованиях не проведена. Кроме того, еще одной труднореализуемой на практике особенностью является необходимость изменения параметров работы MALDITOF, используемых для видовой идентификации микроорганизмов.

5. Иммунохроматографические тесты. Иммунохроматографические тесты отличаются высокой чувствительностью, скоростью получения результата (около 15 мин) и возможностью определения типа фермента. Материалом для исследования является суспензия исследуемой бактериальной культуры. В настоящее время существуют комбинированные тесты для одновременной детекции карбапенемаз, относящихся к группам KPC, OXA-48, VIM, IMP и NDM.

Пример.  ИХТ «NG-Test CARBA5» для определения карбапенемаз KPC, OXA, VIM, IMP и NDM. Положительный результат на карбапенемаз KPC и OXA-48.

6. Селективные хромогенные среды для детекции механизмов резистентности

В последние годы были созданы хромогенные селективные среды для детекции резистентных бактерий в образцах от больных, позволяющие сократить время исследования. Такие среды содержат хромогенный субстрат, который позволяет выявить видоспецифические ферменты микроорганизмов, такие как α-глюкозидазу и β-галактозидазу. Под действием бактериального фермента хромогенный субстрат расщепляется, выделяя в среду хромофор, который окрашивает колонию микроорганизма в определённый цвет. Большинство хромогенных сред также содержат антибиотики и селективные добавки, подавляющие прочую микрофлору.

Хромагары с селективными добавками обеспечивают скрининг продукции ESBL и карбапенемаз через 24 часа от начала исследования, например, CHROMagar ESBL, CHROMagar KPC. На селективных средах можно выделять энтерококки с приобретенной устойчивостью к ванкомицину, имеющие vanA и vanB генотипы резистентности. Перечень селективных сред достаточно широк: CHROMagarТМVRE (CHROMagar, Франция), ChromIDТМVRE (BioMerieux, Франция), VRESelect (Bio-Rad Laboratories, США), Spectra VRE (Remel, США) и другие.

7. Быстрые фенотипические тесты АБЧ из культур крови

Для лабораторий, не имеющих ресурсов для инвестирования в новые технологии, была предпринята попытка разработать и стандартизировать модифицированную версию ДДМ в качестве быстрого фенотипического подхода к АБЧ непосредственно из положительных культур крови.

Тест прямого диско-диффузионного анализа крови является быстрым фенотипическим тестом, который выдает результаты непосредственно из положительных бульонов с культурой крови через 8–10 ч или 16–18 ч (в зависимости от антибиотиков) инкубации. В отличие от обычного теста, он не требует изоляции чистых колоний, что обеспечивает получение результатов на 22 ч раньше.

Этот тест проводится одновременно с быстрым идентификационным тестом, таким как быстрый молекулярный тест или MALDI-TOF MS. До сих пор стандартизированные процедуры доступны только для положительного бульона с культурой крови с грамотрицательными бациллами, в частности, Enterobacterales, P. aeruginosa и видами Acinetobacter. Эта процедура должна быть выполнена в течение 8 ч после того, как флакон с культурой крови покажет положительный результат. Вкратце, в общей сложности 12 капель крови распределяются по поверхности агара Миллера-Хинтон. Затем соответствующие диски с антибиотиками (в зависимости от микроорганизма) распределяются по поверхности инокулированной пластины и инкубируются в течение 8–10 часов или 16–18 часов.

Этот высокоточный метод может использоваться для неприхотливых патогенных бактерий и обеспечивать результаты восприимчивости на день раньше. Он недорогой и может быть легко внедрен в лабораториях, которые уже используют ДДМ. Для дальнейшего сокращения времени выполнения работы может помочь полная автоматизация лабораторных приборов при настройке и считывании результатов.